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    蘭州大學(xué)范增杰:協(xié)同緩解肌肉力量減退促進(jìn)神經(jīng)再生的仿生海參微針神經(jīng)導管

    更新時(shí)間:2024-06-12      點(diǎn)擊次數:115

    周?chē)窠?jīng)損傷(Peripheral nerve injury,PNI)是一種常見(jiàn)的外傷性疾病,常由車(chē)禍、戰傷、工傷和醫療事故等引起。PNI的典型臨床表現為受損神經(jīng)所支配的區域出現感覺(jué)和運動(dòng)功能障礙,其嚴重程度因損傷程度而異。這種疾病給患者帶來(lái)了極大的痛苦與不便,嚴重影響了他們的生活質(zhì)量;同時(shí),也給患者與社會(huì )帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟負擔。

    PNI的傳統治療方法可分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療兩類(lèi)。非手術(shù)治療方法包括電刺激、磁刺激、激光光療等,而手術(shù)治療方法包括神經(jīng)縫合術(shù)和神經(jīng)移植術(shù)(包括同種異體移植和自體移植)。其中,自體移植術(shù)因其療效最佳,被認為是PNI治療的“金標準"。然而,目前的PNI傳統治療方法仍然存在較大的局限性,主要體現在以下兩個(gè)方面:自體移植術(shù)所需的供體神經(jīng)來(lái)源有限,且術(shù)后存在潛在的致畸、致癌性等風(fēng)險;此外,PNI并發(fā)的肌肉力量減退問(wèn)題也會(huì )進(jìn)一步影響功能恢復的效果。

    針對以上兩方面,蘭州大學(xué)口腔醫學(xué)院范增杰教授團隊設計開(kāi)發(fā)了一種具有海參仿生特性的微針神經(jīng)導管(MNGCs),用于PNI及其導致的肌肉力量減退的協(xié)同高效治療。該MNGCs是由摩方精密 microArch®S230 (精度:2μm)高精度3D打印設備加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成。相關(guān)研究成果以“Sea Cucumber-Inspired Microneedle Nerve Guidance Conduit for Synergistically Inhibiting Muscle Atrophy and Promoting Nerve Regeneration"為題發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊《ACS Nano》上。蘭州大學(xué)口腔醫學(xué)院碩士研究生胡策文、劉斌為共同第一作者,蘭州大學(xué)口腔醫學(xué)院范增杰教授和康涅狄格大學(xué)化學(xué)與生物分子工程系孫陸逸教授為共同通訊作者。




    海參是一種海生軟體動(dòng)物,體型呈圓筒狀,體表外側長(cháng)有規則排列的錐形狀疣足,內側則長(cháng)有規則排列的條狀肌肉。海參的體壁柔軟,含有大量的膠原。膠原因具有不對稱(chēng)的晶體結構,具有壓電效應。受此啟發(fā),作者根據海參的生理特性和解剖特征設計了MNGCs。

    MNGC由聚己內酯(PCL),還原氧化石墨烯(rGO)和納米氧化鋅顆粒(ZnO NPs)組成。其中,PCL為MNGCs的基質(zhì)材料,使MNGCs具有良好的柔韌性與生物相容性;rGO和ZnO NPs分別賦予了MNGCs良好的導電性能與壓電性能,使MNGCs能產(chǎn)生并傳導適宜的電刺激(ES)。這是模仿了海參具有產(chǎn)生并傳導生物電的潛力的生理特性。同時(shí),MNGCs的外側為微針(MNs)的針尖,內側為微通道;MNs可以刺入神經(jīng)周?chē)∪獠鲗S,而微通道可以引導雪旺細胞(SCs)定向生長(cháng)。這是模仿了海參具有錐形疣足和條帶肌肉的解剖特征。MNGCs植入體內后,因形變而實(shí)現力電轉換產(chǎn)生ES。在MNGCs的內側,ES與微通道共同使SCs定向高效遷移,促進(jìn)軸突和髓鞘的新生進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)的新生;同時(shí),在MNGCs的外側,ES通過(guò)MNs向其插入的肌肉中傳導ES,進(jìn)而抑制肌肉力量減退。最終實(shí)現了PNI及其導致的肌肉力量減退的高效協(xié)同治療。


    圖一. MNGCs設計、制備以及協(xié)同治療的示意圖。



    首先制備了具有良好導電性能和壓電性能的復合材料PG與PZG。MNGCs的基質(zhì)材料——PCL原本是不具有導電性能和壓電性能的材料,向其中添加了rGO(PG)和rGO+ZnO NPs(PZG)后,復合材料的導電性能明顯提升,也具有了壓電性能。當rGO含量為2%時(shí),其電導率為1.03*10-3S/cm;而當ZnO NPs含量為2%時(shí),其可輸出的電壓和電流的最大值分別為4.6 V和1.9 μA。這一優(yōu)良的電學(xué)特性具有充足的潛力促進(jìn)PNI及肌肉力量減退的協(xié)同治療。又因為rGO和ZnO NPs具有潛在的生物毒性,通過(guò)MTT法對其在PCL中的含量進(jìn)行了篩選,發(fā)現當rGO和ZnO NPs的含量≤2%,材料仍具有良好的生物相容性(見(jiàn)圖3-A&B)。因此,確定PG與PZG中 rGO和ZnO NPs的含量為2%,并進(jìn)行后續實(shí)驗。


    圖二. PG與PZG的電學(xué)性能。(A). rGO含量不同時(shí)PG的電阻率。(B). rGO含量不同時(shí)PG的電導率。(C).PZG的PFM振幅圖。(D)和(E). ZnO NPs含量不同時(shí)PZG的開(kāi)路電壓。(F)和(G). ZnO NPs含量不同時(shí)PZG的短路電流。



    研究團隊使用上述PCL,PG與PZG作為材料,通過(guò)模板法制備了MNGCs。如圖三所示,藍色的模板為制備MNs用的PDMS陰模。此PDMS陰模的制備過(guò)程如下:先使用摩方精密microArch®S230 3D打印設備構建主MNs,再使用PDMS轉寫(xiě)主MNs以獲得PDMS陰模。材料注入PDMS陰模后,使用摩方精密microArch®S230 3D打印設備構建的黃色模板——塑料微通道模板,此微通道模板是直接由設備構建而來(lái)。MNs基底背側的微通道構建完畢且MNs冷卻后,將其取出并卷成管狀,即可獲得MNGCs。


    圖三. MNGCs的制備流程。



    隨后對MNGCs進(jìn)行了理化組成、宏微觀(guān)形貌與力學(xué)性能的分析。FTIR,XRD首先證明了MNGCs中含有PCL和ZnO NPs,Raman不僅證明了MNGCs中含有rGO,且此rGO是被成功還原的。PCL在添加了rGO和ZnO NPs后,由疏水轉變?yōu)橛H水,且親水性較優(yōu)秀,這有利于其生物應用。SEM證明了MNGCs中的MNs和微通道具有良好的微觀(guān)形貌,而MNGCs的宏觀(guān)形貌也與海參高度相似。MNGCs的導管主體部分均具有較好的拉伸性能,能夠穩定橋接神經(jīng)而不斷裂;由PG和PZG制成的MNGCs的MNs針尖部分也具有較好的壓縮性能,能夠刺穿并插入肌肉中,為ES的高效傳遞創(chuàng )造條件。



    圖四. MNGCs的表征。(A). MNGCs的FTIR圖譜。(B). MNGCs的XRD圖譜。(C). MNGCs的Raman圖譜。(D)和(E). 不同MNGCs的水接觸角照片及其定量分析。(F)和(G). MNGCs的MNs與微通道的SEM照片及其EDS分析。(H).MNGCs的數碼照片。(I)和(J).MNGCs的導管本體的拉伸試驗的應力-應變曲線(xiàn)及其楊氏模量。(K)和(I). MNGCs的MNs的壓縮試驗的試驗力-位移曲線(xiàn)及其位移量為0.75mm時(shí)的試驗力。


    在體外層面對MNGCs促進(jìn)PNI修復的效果進(jìn)行了驗證,研究團隊發(fā)現微通道能通過(guò)限定SCs的分布來(lái)引導其定向生長(cháng)增殖,而ES的促進(jìn)作用和導電微環(huán)境的改善均有利于提升SCs的線(xiàn)性遷移速率,其中ES的促進(jìn)作用更為明顯。上述兩方面的共同作用使得SCs能在MNGCs內部高效定向遷移,進(jìn)而促進(jìn)PNI的修復。


    圖五. MNGCs促進(jìn)PNI修復的體外效果。(A). PG的細胞毒性。(B). PZG的細胞毒性。(C). 微通道引導SCs定向生長(cháng)的效果。(D). 雙重電學(xué)功能促進(jìn)SCs遷移的效果。



    研究團隊建立了大鼠的坐骨神經(jīng)大范圍損傷模型,在體內層面對MNGCs協(xié)同緩解肌肉力量減退和促進(jìn)神經(jīng)再生的效果進(jìn)行了研究。首先研究了MNGCs緩解肌肉力量減退的效果。對腓腸肌健側/患側進(jìn)行了對比,發(fā)現PZG-MNGCs組的腓腸肌力量減退程度,不論是大體觀(guān)察狀態(tài)還是濕重比均接近自體移植治療的效果。Masson染色的結果,即PZG-MNGCs組的腓腸肌的肌纖維面積最高且膠原纖維面積較低,也印證了這一結論。因此可以確定,PZG-MNGCs緩解PNI導致的肌肉力量減退效果優(yōu)異。


    圖六. MNGCs緩解肌肉力量減退的體內效果。(A). 患側/健側腓腸肌大體觀(guān)察的照片。(B). 患側腓腸肌的Masson染色圖片。(C). 患側/健側腓腸肌的濕重比。(D). 患側腓腸肌Masson染色的平均肌纖維面積。(E). 患側腓腸肌Masson染色的平均膠原纖維面積。



    隨后研究了MNGCs促進(jìn)神經(jīng)再生的效果。通過(guò)對新生神經(jīng)進(jìn)行甲苯胺藍(新生軸突)和勒克索固藍(新生髓鞘)和CD31-IHC(新生微血管)染色,發(fā)現PZG-MNGCs組的神經(jīng)再生水平接近自體移植治療組。


    圖七. MNGCs促進(jìn)神經(jīng)再生的體內效果。(A). 新生神經(jīng)的甲苯胺藍染色圖片。(B). 新生神經(jīng)的勒克索固藍染色圖片。(C). 新生神經(jīng)的CD31-IHC染色圖片。(D).新生神經(jīng)中活躍SCs的密度。(E). 新生神經(jīng)中髓鞘的密度。(F). 新生神經(jīng)中CD31的密度。



    最后研究了MNGCs促進(jìn)神經(jīng)再生的潛在機制。將NF-200(軸突)和S-100β(髓鞘)作為標記為進(jìn)行IF染色,發(fā)現PZG-MNGCs組中NF-200和S-100β的表達水平接近自體移植治療組。這說(shuō)明PZG-MNGCs主要依靠施加ES+改善導電微環(huán)境來(lái)促進(jìn)軸突和髓鞘的再生,進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)的再生。


    圖八. MNGCs促進(jìn)神經(jīng)再生的潛在機制。(A). 新生神經(jīng)的NF-200的IF染色圖片。(B). 新生神經(jīng)的S-100β的IF染色圖片。(C). 新生神經(jīng)中NF-200的密度。(D). 新生神經(jīng)中S-100β的密度。



    綜上所述,具有海參仿生特性的PZG-MNGCs能高效產(chǎn)生并傳導壓電ES,在確保穩定橋接缺損神經(jīng)和可以向肌肉傳遞ES的前提下,通過(guò)內側的微通道共同促進(jìn)SCs遷移以促進(jìn)神經(jīng)再生,同時(shí)將ES通過(guò)MNs傳遞至周?chē)∪?,最終在協(xié)同緩解肌肉力量減退和促進(jìn)神經(jīng)再生中取得了相當接近自體移植治療這一“金標準"的治療效果。


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